2022年10月27日，太阳成集团tyc7111cc伊成器课题组联合北大医学部药学院王晶课题组联合在Nature Biotechnology杂志上在线发表了题为“Absolute quantification of single-base m⁶A methylation in the mammalian transcriptome using GLORI”的研究成果。

m⁶A是高等真核生物mRNA内部含量最丰富的修饰，大约0.2-0.6 %的腺苷中存在m⁶A修饰。m⁶A依赖修饰酶、去修饰酶和结合蛋白发挥调控功能。目前已发现m⁶A具有调控mRNA剪接、出核、稳定性和蛋白翻译等功能，可以参与发育、配子发生、细胞重编程、生物节律、疾病等多种生理和病理过程的功能调控。为了更好地研究m⁶A生物功能和临床病理研究，开发m⁶A高通量测序技术一直是m⁶A领域的热点。

尽管目前已经开发了多种m⁶A检测和测序方法，但是现有的技术仍然存在以下局限性：（1） 基于m⁶A抗体的检测方法无法获得其高分辨率的位点信息。（2）基于限制性内切酶的检测技术只能检测含有ACA 基序的m⁶A。（3）基于三代测序和机器学习的方法价格昂贵、检测准确性低等问题，且不能够实现对m⁶A的绝对定量。迄今为止，对m⁶A全转录组的无偏好检测和绝对定量仍未得到解决。

新开发的m⁶A检测技术“GLORI”突破了以上技术局限性，首次实现了真正意义的高效率、高灵敏度、高特异性、无偏好单碱基m⁶A位点检测，并对m⁶A位点的修饰水平进行绝对定量。GLORI的技术核心是不依赖于抗体，通过化学反应组合筛选发现乙二醛和亚硝酸盐的催化体系，对未甲基化的腺苷进行高效地脱氨从而形成肌苷(A-to-I, > 98%)，肌苷在测序过程中被读成鸟苷(G)，形成A-to-G的转化；而m⁶A则仍被读成A。GLORI通过检测测序的读段序列中A所占的比例，实现了对单碱基m⁶A的绝对定量。因此，GLORI技术在概念上类似于利用亚硫酸氢盐定量分析基因组5mC的含量。

图1：GLORI 的检测原理。

a, GLORI实现A-to-I的转化。b, GLORI的化学反应过程。c, GLORI中乙二醛和亚硝酸盐介导脱氨作用前后(上)和(下)的LC-MS/MS分析。d, GLORI技术在基因MRPS26上定量检测m⁶A位点的例子。

随后，研究团队在HEK293T转录组中，鉴定出了176,642个m⁶A位点，并且发现，随着测序深度的增加，可检测的m⁶A位点可以进一步的增加，该结果扩展了人们对mRNA上m⁶A存在数量的认识。此外，GLORI技术能够实现对m⁶A的准确定量：即使修饰水平较低的m⁶A（5%），GLORI也能够实现准确检测。随后对含有不同m⁶A修饰水平的mRNA进行功能分析发现，mRNA上整体m⁶A的修饰水平和RNA的转录水平及翻译效率都呈现负相关关系。至此，GLORI首次实现了全转录组的m⁶A定量图谱，也完成了对基因表达和翻译调控的定量评估。

图2：GLORI转录组内定量检测m⁶A。

a, GLORI在HEK293中检测的位点。b, GLORI能够准确检测spike-in中m⁶A位点的修饰水平。c, GLORI检测的m⁶A位点的修饰水平在技术重复之间的相关性。d，HEK293中m⁶A位点修饰水平的整体分布。e, 含有不同m⁶A修饰水平的mRNA的转录水平。f, 含有不同m⁶A修饰水平的mRNA的翻译效率比较。

此外，研究团队发现在一些基因的特定区域中出现了一类聚集分布的m⁶A位点（m⁶A簇）。相比于不具有这类m⁶A簇的基因，这类m⁶A簇的基因显著降低基因的转录水平和翻译效率，从而负调控基因的表达。

图3：m⁶A簇的发现与功能。

a, SPEN基因的特定区域有聚集分布的m⁶A簇。b, 参与形成m⁶A簇的m⁶A位点具有显著高的修饰水平。c, 具有m⁶A簇的mRNA具有显著低的转录水平。d,具有m⁶A簇的mRNA具有显著低的翻译效率。

该研究进一步将GLORI技术应用于热休克及缺氧的两种压力体系和HeLa及MEF两种细胞系中观察m⁶A的动态调控，并提供了转录组上m⁶A对压力条件应激的定量图谱。研究发现，在两种压力体系下约有4.8-11% m⁶A位点具有动态变化，并且上调和下调的m⁶A位点表现出不同的富集模式：在缺氧时，上调和下调的位点分布富集在5′UTR和终止密码子附近，而热休克体系中这种富集则呈现相反的趋势。不同于野生型细胞中m⁶A对基因表达的负调控作用：在热休克条件下，m⁶A整体修饰水平升高的mRNA的翻译效率显著上调，且这种上调的调控作用在具有m⁶A簇的mRNA中更为显著。该结果提示了m⁶A在不同环境下对基因表达具有特异性的调控。

图4：GLORI检测动态变化的m⁶A。

a, 缺氧诱导m⁶A位点的mRNA分布图谱。b, 热休克诱导m⁶A位点的mRNA分布图谱。c, 热休克前后MEF细胞中上调m⁶A相关基因翻译效率的箱线图和点图。d, 热休克后具有或不具有m⁶A簇的基因的翻译效率的箱线图。

综上，该研究展示了GLORI技术高灵敏度、高特异性的无偏好绝对定量检测m⁶A的特性，突破了目前m⁶A定量测序技术的瓶颈。基于其在检测m⁶A方面的优异表现，GLORI将有助于推动和解决m⁶A在细胞分化、胚胎发育和临床检测等多种领域中的功能研究和核心生物学问题, 有望成为定量m⁶A测序技术的“金标准” 。

太阳成集团tyc7111cc伊成器教授和太阳成集团tyc7111cc医学部药学院王晶研究员为本研究论文的共同通讯作者。太阳成集团tyc7111cc博士后刘聪、博士生孙含笑，太阳成集团tyc7111cc药学院博士后衣云鹏（已出站）、直博生申卫国和太阳成集团tyc7111cc李楷为论文的共同第一作者。该工作得到科技部重点研发计划和国家自然科学基金等项目资助。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-022-01487-9